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本试剂盒是一款简便、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50bp～10kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15～25bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃反应20min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。

本试剂盒中2×HiperClone MultiS Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了独特的重组增强因子，可显著提高重组克隆效率。使用该试剂盒，可以一次实现多至5个片段的顺序拼接克隆。

快速克隆；定向克隆；定点突变。

组分	规格
2×HiperClone MultiS Enzyme Premix	100μL
500bp Control Insert (25ng/μL)	5μL
pUC 19 Control Vector,linearized (50ng/μL)	5μL

保存：-20℃，有效期1年。



图1．HiperClone多片段一步法快速克隆试剂盒实验流程图。

• 载体线性化：酶切或反向PCR制备线性化载体。
  
• 插入片段的制备：由PCR制备，所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源序列（图中以红色、黄色、紫色和绿色标记)，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段同源序列。
  
• 重组反应：按比例混合线性化载体和插入片段，在重组酶催化作用下，50℃反应20min即可完成重组。
  
• 转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板。

一、制备线性化载体
选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。建议尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。载体克隆位点上下游25bp区域内GC含量均在40%～60%范围内最佳。线性化载体可通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。

• 酶切制备线性化载体
  
  • 双酶切线性化：线性化完全，转化背景低。建议使用。
    
  • 单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
    注：不含插入片段的假阳性克隆是由未线性化环状载体转化而形成的。若这种假阳性克隆比例较高，建议重新制备线性化载体。
• 反向PCR扩增制备线性化载体
  建议使用高保真聚合酶（如：Hiper Canace High-Fidelity DNA Polymerase，货号：SY1501）进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
  HiperClone重组反应体系兼容几乎所有酶切反应体系和常规PCR反应体系，当载体酶切产物或反向PCR扩增产物纯度较高时，可以无需纯化，直接进行重组反应。但纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒时，建议使用高质量的试剂盒对线性化载体进行胶回收纯化，以提高产物纯度并去除一部分未线性化的环状载体，有利于提高重组效率。

二、PCR扩增制备插入片段

• 设计扩增引物
  HiperClone引物设计方式：通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15～25bp（不包括酶切位点）的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的完全一致的序列。
  可参照以下实例。以在pUC18载体（注：与该试剂盒中提供的C组分不同，C组分为pUC19）的EcoR I和Hind III酶切位点间插入三段基因的引物设计为例，引物具体设计方案如下：
  首先，设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插入片段)。
  第一片段正向扩增引物设计方式：
  5’—上游载体末端同源序列+酶切位点（可保留或删除）+第一片段基因特异性正向扩增序列—3’
  第三片段反向扩增引物设计方式：
  3’—第三片段基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可保留或删除）+下游载体末端同源序列—5’
  注：
  ① 基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
  ② 上游/下游载体末端同源序列为线性化载体最末端序列（用于同源重组），GC含量40%～60%为佳。
  
  图2．与载体相邻的两个插入片段引物设计方案。
  其次，设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段（第一片段）的反向扩增引物中为例，引物具体设计方案如图3所示：
  第一片段反向扩增引物设计方式：
  3’—第一片段基因特异性反向扩增序列+第二片段5’端同源序列—5’
  第二片段正向扩增引物设计方式：
  5’—第二片段基因特异性正向扩增序列—3’
  注：
  ① 基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
  ② 第二片段5’端同源序列即用于第一片段与第二片段进行重组的添加序列。
  最后，设计第二片段的反向扩增引物和第三片段的正向扩增引物。设计方式与第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方式一致。具体方案参见图3。
  
  图3．第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方案
  注：最终引物长度超过40bp，建议选用PAGE纯化方式进行引物合成。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算，为了得到高效率克隆，建议Tm≥48℃。
  
• 插入片段PCR扩增
  插入片段扩增可用任意PCR酶扩增，无需考虑产物末端有无A尾(重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变的引入，建议使用高保真聚合酶进行扩增（Hiper Canace High-Fidelity DNA Polymerase，货号：SY1501）。
  PCR扩增结束后，取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳以检验扩增产量和特异性。HiperClone重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如果扩增模板不是与载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，则扩增产物可以无需纯化，直接用于重组反应。但PCR扩增产物纯度较低时，建议使用高质量的试剂盒对PCR扩增产物进行胶回收纯化，以提高产物纯度，有利于提高重组效率。

三、线性化载体与插入片段浓度测定
推荐使用琼脂糖凝胶电泳比较条带亮度的方法对DNA进行定量。将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各取1μL进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子量标准（DNA Marker）比较条带亮度以确定其近似浓度。

四、重组反应

• 线性化载体与插入片段使用量计算
  HiperClone Plus Multi重组反应体系最适DNA使用量为每片段（包括线性化载体）0.03 pmoL。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
  每片段最适使用量= [0.02×载体碱基对数]ng (0.03 pmoL)
  例如，将长度为0.5kb、1kb、2kb三插入片段克隆至长度为5kb的载体时，各片段最适使用量应为：
  线性化载体最适使用量：0.02×5000 = 100ng；
  
• 5kb插入片段最适使用量应为：0.02×500 = 10ng；
  1kb插入片段最适使用量应为：0.02×1000 = 20ng；
  2kb插入片段最适使用量应为：0.02×2000 = 40ng。
  注：
  
  • 插入片段DNA使用量应大于10ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用10ng即可。
    
  • 线性化载体的使用量应在50～200ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择最低或最高使用量即可。
    
  • 线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20μL体系不超过4μL。
• 反应体系（推荐冰上配制，各组分使用前需混匀）
  

  组分	重组反应	阴性对照-1	阴性对照-2	阳性对照
  ddH2O	至20μL	至20μL	至20μL	至20μL
  2×HiperClone MultiS Enzyme Premix	10μL	0μL	0μL	10μL
  线性化载体	X μL	X μL	0μL	1μL
  N个插入片段	Y μL	0μL	Y μL	1μL

  注：
  
  • X和Y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用量。
    
  • 阴性对照-1可用来确认线性化载体有无环状质粒残留，可选择性进行。
    
  • 当插入片段扩增模板是与载体抗性相同的环状质粒时，可用阴性对照-2来确认有无环状质粒模板残留，可选择性进行。
    
  • 试剂盒中提供阳性对照反应所需组分（B组分和C组分），可用来排除其他实验材料及操作因素的影响，可选择性进行。
• 重组反应
  
  • 体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。
    
  • 置于50℃反应20～50min。当插入片段总和＞5kb时，建议提高孵育时间到30～50min可以增大重组效率。
    注：建议在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。
    
  • 待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5min，以防温度过高降低感受态转化效率。
    
  • 反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

五、重组产物转化、涂板

• 在冰上解冻克隆感受态细胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，货号：SY0012）。
  
• 取10μL冷却重组产物，加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。
  
• 42℃热激90秒，冰浴孵育2min。
  
• 加入900μL SOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃，200rpm，摇菌45min。
  
• 5000rpm离心3min，弃掉900μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。

六、克隆鉴定
最方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20～50μL LB培养基中混匀，直接取1μL作为PCR模板。推荐至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。后续也可做酶切或测序鉴定。
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